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    公开号:WO1989005154A1
    申请号:PCT/T1988/000104
    申请日:1988-11-30
    公开日:1989-06-15
    发明作者:Oskar KÖLBL
    申请人:Koelbl Oskar；
    IPC主号:C12N7-00
    专利说明:
    Verfahren zur Herstellung eines avirulenten KaltDlutervirus Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zurHerstellung eines avirulenten Kaltblütervirus, insbesondere Rhabdovirus. Im vorliegenden Fall handelt es sich um einVerfahren zur Herstellung von Jenen Rhabdoviren, die entweder die Frühjahrsvirämie der Karpfen hervorrufen, also um Rhabdovirus carpio, oder um Jene Viren, die die virale, hamorrhagische Septikamieder Forellen hervorrufen. Jene Virusstëmme,die die Frühjahrsvirämie der Karpfen hervorrufen, werden im folgenden mit SVC, und gene, die die virale, hämorrhagische SeptikamiederForellen hervorrufen, mit VHS bezeichnet. Von denVHS-Viren werden derzeit 3 Subtypen beschrieben, die serologisch verwandt sind. Bei Verabreichung an verschiedene Tierarten kann es zu einer unterschiedlichenImmunantwort auf die antigenen Determinanten eines Virusstammeskommen. Unter natürlichen Bedingungen erkranken die zu den Salmoniformes zahlendenFische anVHS. Andere Fischarten, wie Esche, Hecht und Renke, zeigen nach Infektion gelegentlich mehr oder weniger ausgepragteVHS-Krankheitssymptome. Bei Fischen mit einemGewicht über 2g ist oberhalbeiner Temperatur von 14C die Zahlder Erkrankungen stark reduziert oder Uberhauptfehlend. Die Bekämpfung der VHS ist wegen der nach einerInfektion zurückbleibendenVirusträger sehr schwierig und kostenaufwendig. (Ahne W., Zbl.Vet.Med. B, 32, (1985): 237-264,Meier W. u. M., J. of Applied Ichthyology 2, (1986): 181-186, Ahne W. u. M., J. of Applied Ichthyology 2 (1986): 187-189) Das Rhabdovirus carpio ist serologisch einheitlich. Nach P.J. Enzmennund Konrad M., Tierärztl.Umschau 39 (1984): 886-892,ist die Entwicklung eines Impfstoffes gegen die VHS bisher nicht geglückt.Passagen inKaltblüterzellkulturen führen zur Avirulenz der VHS-Virusstëmme.Dabei geht jedoch auch die immunisierende Eigenschaft weitgehend verloren (Kölbl0.,Diagnose und Behandlung von Fischkrankheiten, DVG,München 1978, S 61 - 76) Die FR-PS 2 492 841 bezieht sich auf die Attenuierung des VHS-Virus an EPC-Zellen. EPC-Zellen stammen vomKarpfen, sind also Kaltblüterzellkulturen. Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde,Virusstamme zu erzielen, welche avirulent sind und gegebenenfalls einen cytopathischen Effekt (CPE)erzeugen. Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe dadurch gelt,dass nach Isolierung oder nach Passagen des Virus in Kaltblüterzellendieses durch Passagen bei stufenweiser Temperaturerhohungauf bis zu 300 C an Warmblüterzellen, vorzugsweise Hühnerfibroblasten, adaptiert und gegebenenfalls in diesen Zellen vermehrt wird. Dadurch wird erreicht, dass die Virusstämme ihre Virulenz verlieren, jedoch ihre immunisierenden Eigenschaften erhalten und damit eine Impfung der Fische ermoglichen,da eben die Attenuierung der Rhabdoviren an Warmblüter- ellendie Avirulenz dieer Virustammebei Erhaltung der immunisierenden Eigenschaften ergibt. Ein Vorteil einerAdaptierung der Fischviren an Warmblüterzellkulturen besteht auch darin, dass MassenkulturenbestimmterWarmblüterzellen, wie z.B. BHK 21 oder Hühnerfibroblasten, billiger hergestelltwerden kdnnenalsKaltblüterzellkulturen, so dass die Viruszüchtung für eineImpfstoffproduktion wirtschaftlich günstigerfolgen kann, da die so erhaltenen Stämme in Vakzinen antigene Wirkung zeigen. Nachfolgend wird das Verfahren zunachstanhand desSVC-Virus und dann an hand des VHS-Virus näher beschrie-ben. A) Adaptierung und Attenuierung des SVC-Virus Nach Anzüchtung des SVC-Virus auf Kaltblüterzellenwie EPC- und FHM-Zellen wird das Virus entweder sofort oder erst nach Passagen in diesen Zellen auf Warmblüter- zellen, vornehmlich auf primare Hühnerfibroblastenzell-kulturen, übertragen. Nach 6 bis 10 Passagen kommt es zumAuftreten eines cytopathischen Effektes (CPE). Ausgehend von 20 C wird durch stufenweise Erhöhung der Temperatur eine Züchtungstemperaturvon 300 C erreicht. DieAnzüchtberkeit dieser so adaptierten Virusstämme auf Kaltblüterzellenist gegeben. Die SVC-Stämmeerwerben durch die Passagierung folgende Eigenschaften: CPE aufWarmblüterzellen; die Uberlebensratebei hdheren Temperaturen (300C bis 37 C) ist wesentlich erhöht;dasWachstum auf anderen Warmblüterzellen, wie z.B. BHK-21-,Vero-, MOBK-, IBRS-, A 72-Zellen, ist mit CPE bei 20 C bis 300 C gegeben; die krankmachenden Eigenschaften nehmen bis zur Avirulenz ab, die immunisierendenEigenschaften bleiben erhalten. B) Prüfung des attenuierten SVC-Virus auf Virulenz und immunisierende Eigenschaften Die Virulenzprüfungwird vorgenommen durchVerabreichung des attenuierten SVC-Virus an spezifisch pathogenfreie (SPF-) Karpfen. Diese Karpfen werden in einem Wasser, das 10SKID50 Virus pro ml enthält, 2Stunden long gebadet. Die Wassertemperatur während des gesamten Versuchszeitraumes von 2 Monaten liegt unter 16 C, am besten bei 100 C. Alle Fische Uberlebenbei avirulenten Virusstammen. Die Immunittwird durch Infektion von geimpftenKarpfen mit virulentem Virus geprüft.Infektionsdosis undInfektionsart sowie Haltung sind gleich wie bei der Virulenzprüfung.Infizierte, nicht geimpfte Kontrollfische sterben alle. Geimpfte Uberleben. C) Herstellung eines Impfstoffes Die Impfstoffherstellung kann mit dem attenuiertenVirus per se oder mit Klonen des attenuierten Virus erfolgen. Klone mit grower Plaquebildung haben eine bessere immunisierende Eigenschaft. Die Virusvermehrung kann vorgenommen werden in Kaltblüterzellen,wie z.B. EPC- oder FHM-Zellen, oder aber in Warmblüterzellen, wie z.B. primäre Hühnerfibroblasten. Geeignet sind stationareMonolayer oder Aollkulturen wie auch Suspensionskulturen, wobei ein Mindesttiter von 107KID50 pro ml erreicht wird. Vorzugsweise werden Bollkulturen mit Hühnerfibroblasten verwendet. Ein Virustiter bis zu 109KID50 pro ml kann damit erreicht werden. Als Stabilisatoren geeignetsind vorzugsweise Glutamin, Gelatine, hydrolysierte Gelatine,Phosphat, Saccharose, Sorbit, Pepton oder Gemischedavon. D) Anwendung des Impfstoffes Der Impfstoff kann verabfolgtwerden über dasFutter, durch ein Bad oder durch Injektion. Die Impfung wird vorzugsweise im Sommer durchgeführt. Der Impfstoff sollte zweimal im Abstand von mindestens 3 Wochen bis höchstens 3 Monaten verabfolgtwerden. Ist die Wassertemperatur hoch, kann der Abstand geringer sein, ist sie niedrig, sollte der Abstand zwischenden Impfungenlänger bemessen werden.Nachfolgend ist ein konkretes Ausführungsbeispiel wiedergegeben. Adaptierung und Attenuierung eines SVC-Stammes Zunachstwurden 50x wöchentliche Passagen inEPC-Zellen bei 20 C, gefolgt von 120 Passagen in primaren HhnerfibroblastenzeIlkulturen, durchgeführt. Dann wurde durch schrittwsise Erhdhungder Temperatur um 2 bzw. 30 C eine Anpassung auf 300 C erreicht, wobei jederSchritt einer Temperaturerhohung5 - 30 Passagen umfasste. Gelegentlichwaren Zwischenpassagen in EPC- oderFHM-Zellen erforderlich. Schliesslich folgten50 Passagen bei einer Temperatur von 300 C. Insgesamt wurden 350Passagen durchgeführt. Herstellung eines Impfstoffes Primäre Hühnerfibroblastenzellkulturen wurden mittels Eagle MEM (minimum essential medium) + 5 %Rinderserum in Rollkulturen angezüchtet.3 TagenachZelleinsaot wurde das Medium gewechseltund die Zellen mit Eagle MEM und 2 % Rinderserum Uberschichtet.DasSaatvirus, 5 x 103KID50pro ml, war dem Medium beigegeben worden. 48 Stunden spatterzeigte die Hälfte bis 3/4 derZellen einen CPE und es wurde das Virus geerntet. Erreichter Virustiter 5 x 108KID50 pro ml. AlsStabilisatoren wurden zugefügt2 % Glutamat und 0,5 %Gelatine oder aber Pepton. Impfung von einsommrigenKarpfen (K1) mittels Bad 44 K1 mit einem durchschnittlichen Gewicht von 30g wurden 2 Stunden bei einer Temperstur von 10 C in einemWasser gebadet, das 5 x 105KID50 pro ml Impfvirus enthielt. Kein geimpfter Fisch starb bis zum 65. Tag nachVerabreichung des Impfstoffes. Eine nachfolgendeInfektion mit einem virulenten SVC-Stamm, in gleicherWeise durchgeführt wie die Impfung, mit einer Virusdosis von 5 x 105KID50 pro ml Wasser, hatte keine Erkrankungsoder Todesfallezur Folge. Von der nichtgeimpftenKontrollgruppe, die zur gleichen Zeit in gleicher Weise infiziert wurde, starben alle. Impfung von Karpfen im 2. Sommer (K1 2)durch Verabreichung des Virus mit dem Futter Das Impfvirus wurde mittels Sojaschrot an Karpfen verabfolgt. Die Impfdosis pro Karpfen war 106KID50.Die erste Impfung war Anfang Juli bei einer Wassertemperatur von 200 C, die zweite Impfung fand Anfang August bei einer Wassertemperatur von 250 C statt. Das Durchschnittsgewicht der Karpfen betrug 18 dag bei der erstenImpfung. Es wurden ca. 50.000 Karpfen in 6 Teichen geimpft. Mit diesen Karpfen aus 6 Teichen wurde im Herbst ein grosser Teich besetzt. Es gab weder in der Impfphase noch nach Besatz des greenTeiches in der Winterung und danach im Frühjahr Verluste. Umzu prüfen, ob die Immunisierung erfolgreich war, wurden von 3 Teichen jeweils15 Fische im Herbst entnommen und einer infektionim Aquarium mit einem virulenten Stamm unterzogen. Die karpfen wurde über dasWasser mit einer Virusdosis von 5 x 105KID50 pro mlWasser infiziert. Die Wassertemperatur betrug 60C. Nach 10 Wochen wurde die Temperatur schrittweise innerhalbvon 8 Tagen auf 14 C erhht.4 Wochen danach wurde derVersuch beendet. Von den 15 Karpfen des 1. Teiches starb einer an SVC. Von den 15 Karpfen des 2. Teiches starben zwei. Die 15 Karpfen des 3. Teiches blieben alle gesund. Adaptierung und Attenuierung des VHS-Virus VHS-Stämmewerden durch die gebräuchlichen Methoden der Anzüchtung in Kaltblüterzellkulturen, vornehmlich in der BTG-2- und FHM-Zellinie aus Fischmaterial isoliert. Die günstigste Anzüchtungstemperatur ist 15 C. Die Ubertragungauf Warmblüterzellkulturen, am besten prime Hühnerfibroblasten, kann sofort oder nach Passagen inKaltblüterzellkulturen erfolgen. Die Anzüchtung derWarmblüterzellkulturen geschieht in der lichenWeise. Es werden am besten Monolayer-Zellkulturen in Röhrchen hergestellt.Nach Anwachsen der Zellkulturen wird dasMedium gewechselt. Das Erhaltungsmedium ist am besten das gleiche, das als Anzuchtmedium verwendet wurde. Es kannSerum zum Erhaltungsmedium, vorzugsweise 1 %, zugesetzt werden. Die Beimpfung der Zellkulturen erfolgt am besten nach dem Mediumwechsel. Sie kann aber auch bereits nach Entfsrnungdes Anzuchtmediums erfolgen. Nach einerAbsorptionszeit von am besten 30 Minuten wird dann dasErhaltungsmedium aufgebracht. Auch die Cokultivierungsmethode ist geeignet. Die Züchtungstemperatursoll dabei genau eingehaltenwerden, wobei die Ausgangstemperatur 17 C +/- 1 C beträgt. Da zunachst kein CPE (cytopathischer Effekt) erkennbar ist, muss die erfolgreiche Anzüchtung kontrolliert werden. Sie erfolgt am besten durchBeimpfung von RTG 2-Zellkulturen. Von jeweilsder letzten Anzüchtung auf RTG-2-Zellkulturen wird wieder einePassage auf RTG 2-Zellkulturen gemacht. Bei Abreissen derPassage in den Säugetierzellen kann von dieser RTG 2-Zellkultur-Virusanzchtungwieder die Adaptierung auf Warmbltergewebekulturzellen versuchtwerden (Wechselpassagen). Die Passagen werden am besten im Abstand von 7Tagen vorgenommen. Kürzere und langereAbstande (bis zu mehrerenWochen) sind aber moglich. Überraschenderweise kann das Kaltblütervirus VHS an eine Züchtungstemperaturvon bis zu 280 C adaptiert werden. Nach 5 - 10 Passagen in Säugetierzellen bei einerTemperatur von 170C +/- 1 C kann mit der Adaptierung an eine höhere Temperatur begonnen werden. Die Temperatursteigerung pro Stufe wird am besten 2 - 30 C betragen. Manchmal ist ein grösserer Schritt srfolgreich.Sollte eine Anzüchtung in Säugetierzellen bie der höherenTemperatur zunächst nicht gelingen, müssen bei 17 C weitere Passagen durchgeführt werden.So wird durch stufenweise Erhdhungder Temperatur um jeweils2 - 30 C eine Adaptierung der Stämme bis zu einerWachstumstemperatur von 280C erreicht. Wechselpassagen, wie oben bereits beschrieben, sind manchmal nötig. Ein CPE kann ab dem Erreichen einerZüchtungstemperatur von 20 C nach mehreren Passagen bei dieser Temperatur beobachtet werden. Zumeist ist dieserCPE aber erst nach mehrerenPassagen ab einer Wachstumstemperatur von 230 C oder 250 C festzustellen. Adaptierte Stämme können auf andere Warmblüterzellsysteme, wie z.B. BHK-21-,Vero-, A 72- oder fetale Rinderlungenzellen übertrogen und darin vermehrt werden. Die Züchtbarkeit auf Kaltblüterzellen, wie z.B. RTG-2und FHM-Zellen, bleibt erhalten. Die Vermehrungkann erfolgen in stationären Monolayer- oder Rollkulturen wie auch in Suspensionskulturen, wobei ein Titer von 107KID50 per ml oder mehrerreicht wird. Mdglichist auch die Vermehrungin einer Suspsnsionskulturaus trypsinierten Hühnerembryonen,der sofort oder nach VorbebrütungSaatvirus zugesetzt wird. Die Züchtungstemperaturbeträgt nach Beimpfung 20 bis 28 C bei Berücksichtigung der erreichten Adaptionstemperatur. Ein Stabilitsator kann bei Beimpfung derKulturen mit dem Saatvirus zugesetzt werden. Als Stabilisatoren sind geeignet: Glutamat,Gelatine, hydrolysierte Gelatine, Phosphat, Sorbit, Sepharose,Saccharose, Pepton oder Gemischedavon. Nach dem beschriebenen Verfahren erhaltenes Virus kann zur Herstellung eines Antiserums für die direkte Immunfluoreszsnz zum Nachweis des VHS-Virus, insbesonderein Fischgewebe und Fischgewebekulturen,verwendet werden. Im folgenden ist ein Beispiel für ein konkretesAusführungsverfahren wiedergegeben. Eine Adaptierung wurde mit 16 VHS-Virusstämmen durchgeführt.Es wurde vorgegangen wie oben fürIsolierung und Adaptierung beschrieben. Die Stufen der Temperaturerhohungwaren: 170C, 200 C, 230 C, 250 C, 280C und 290 C. Die Passagen wurden im allgemeinenim 7Tage-Abstand durchgeführt. Es gab aber auch kürzere und längere Intervalle (4 - 28 Tage) . Bei langerenUnterbrechungen wurden die Stämme bei -40 C oder -80 C nach Zugabeeines Stabilisators (Kalberserum,Glutamat) tiefgefroren. Die primarenHühnerfibroblastenmonolayer wurden mittels Eagle- oder Earle-MEM-Medium mit 3 - 5 %Kälberserum bzw. mit 3 % newborn Kälberserum bzw. mit 3 % fetalem Kalberserum bei 370 C in 2 Tagen angezüchtet.Die Erhaltungsmedien waren die gleichen, die zur Anzüchtung verwendet wurden. DemEagle-Erhaltungsmedium wurde 1Vol.-% bzw. 1/2 Vol.-% der angeführten Sera zugesetzt. Bei Verwendung von Earle-Medium fehlteein Serumzusatz imErhaltungsmedium. Nach 150 - 250 Passagen der imAdaptierungsversuch stehenden Stmmewurden folgendeErgebnisse erzislt:5 Stämme liessen sich auf eine Wachstumstemperatur von 25 C adaptieren unter Ausbildung eines CPE. 4 von diesen Stammen vermehrten sich unter Ausbildung eines CPE auch bei 280 C. Ein weiterer Stamm wuchs bei 250 C. DerCPE dieses Stammes ist aber gering. Ein Stamm liess sich nur bis zu einer Temperatur von 23 C mit geringem CPE adaptieren. Bei 4 Stamenist bisher keine Adaptierung gelungen. Nach bis zu 4 Passagen ist die Virusvermehrung abgerissen.Die restlichen Stamme lassen sich ohneErzeugung eines CPE bei einer Temperatur von 20 C bzw. 23 C passagieren. 2 Stämmer, die auch bei 28 C wochsen, scheinen sich auf 29 C adaptieren zu lassen. Ein CPE ist hier bisher nicht feststellbar. Die Stmmemit Ausbildung eines CPE lassen sich auch in folgenden Zellsystemen unterVerursachung eines CPE vermehren: Kaltblüterzellen:FHM, RTG 2. Wermblüterzellen:BHK 21, Vero, A 72 und sekundarefetaleRinderlungenzellen.
    权利要求:
    Claims
    Patentansprüche:
    Verfahren zur Herstellung eines avirulenten Kaltblütervirus, insbesondereRhabdovirus, dadurch gekennzeichnet, dass nach Isolierung oder nach Passagen des Virus in Kaltblüterzellendieses durch Passagen bei stufenweiser Temperaturerhöhung auf bis zu 300 C anWarmblüterzellen, vorzugsweise Hühnerfibroblasten, adaptiert und gegebenenfalls in diesen Zellen vermehrt wird.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung von avirulenten SVC-Viren (spring viremia of carp, Frühjahrsvirämie) die stufenweise Temperaturerhöhung von 20 C beginnend bis 300 C vorgenommen wird.
    3.Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung von avirulenten VHS-Viren(virale hamorrhagische Septikamieder Forellen) dieAdaptierung durch Passagen bei 17 +/- 10 C begonnen und bis 280 C vorgenommen wird.
    4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daedas an Warmblüterzellen adaptierte Kaltblütervirusauf andere Warmblüterzellen Ubertragenund in diesen Systemen vermehrt wird.
    5. Vakzine gegen Frühjahrsvirämie der Karpfen (SVC), dadurch gekennzeichnet, daesie SVC-Viren enthalt,die nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 und 2 adaptiert und attenuiert sind.
    6. Vakzinegegen virale hamorrhagischeSeptikämie der Forellen, dadurch gekennzeichnet, dass sie VHS-Viren enthält,die nach dem Verfahren gemässAnspruch 1 und 3 adaptiert und attenuiert sind.
    7.Vakzine gemässAnspruch 5und 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Viren mit einem Stabilisator versetzt und gegebenenfalls gefroren oder lyophilisiert sind.
    8. Vakzine nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Stabilisatoren Glutamat, Gelatine, hydrolysierte Gelatine, Phosphat, Sorbit, Sepharose,Saccharose, Pepton oder Gemischedavon enthält.
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    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1989-06-15| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): DK JP NO |
    1989-06-15| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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